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技術文章
TECHNICAL ARTICLES
更新時間：2025-12-10
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在神經毒性測試領域，斑馬魚胚胎因其透明度高、發育過程清晰，已成為重要的生物模型。尤其是在發育神經毒性（DNT）評估中，通過觀察胚胎的自發卷尾運動（Coiling Assay）來檢測化學物質的影響，已成為一種高效的行為學檢測手段。然而，在實驗過程中一個常被忽略的問題是：這些在實驗室中被“隔離飼養"的小小胚胎，它們之間是否存在交流？
以往的研究大多默認將胚胎分組飼養在同一個培養孔中。自然界中，許多卵生動物（如某些魚類、爬行動物）的胚胎之間存在機械振動、化學信號等形式的交流，以實現發育同步或預警危險。斑馬魚胚胎是否也存在類似的“胚胎間交流"？這種交流是否會影響其在毒性測試中的行為表現？本文介紹的研究給出了答案。
為了探究“社交"對行為的影響，研究團隊設計了一套物理隔離方案：
群養組：將5個胚胎固定在一個24孔板的標準培養孔底部中心。胚胎在環內可以自由移動、相互接觸，模擬自然“抱團"狀態；
隔離組：使用定制的板，板上帶有5個獨立的微小凹槽，每個凹槽剛好容納一個胚胎。凹槽間的隔斷確保胚胎無法發生物理接觸，運動軌跡也獨立，實現了物理隔離。
Rotenone是一種天然植物毒素，常用于在斑馬魚中模擬帕金森病癥狀，其神經毒性明確。研究選用Rotenone，實驗設置了四個濃度梯度：1.0， 10.1， 20.3 nM，以及0.1% DMSO溶劑對照。濃度范圍基于前期魚胚胎急性毒性（FET）測試結果，涵蓋了從無效應到明顯效應的區間。
實驗使用野生型斑馬魚胚胎。在胚胎發育的21至47小時這一關鍵窗口期，研究團隊每小時進行一次長達8分鐘的高清視頻錄制。這一時段覆蓋了自發卷尾的起始、高峰及逐漸向游泳行為過渡的全過程。使用斑馬魚微視行為分析系統（DanioScope）分析視頻。軟件通過識別胚胎尾部像素的變化，自動量化兩個核心行為參數：① 平均卷尾爆發次數/分鐘（反映運動頻率），② 平均卷尾持續時間（以秒計，反映單次運動的強度）。
實驗結果通過圖表清晰地揭示，胚胎的“社交生活"對其行為模式產生了深刻影響，甚至改變了它們對神經毒素的反應。
1.Rotenone的毒性在“熱鬧"的群養胚胎中更易顯現
圖1群養組數據顯示，在群養條件下，暴露于ZG濃度Rotenone（20.3 nM）的胚胎，其平均卷尾持續時間（圖1A） 和卷尾爆發頻率（圖1C） 在30小時前均出現顯著下降。這表明在高濃度毒素作用下，胚胎的神經肌肉活動受到了明顯抑制。
一個意外的發現是：部分群養胚胎對毒素的反應是過度活躍，而非抑制。這種劇烈的、無序的運動導致它們的運動軌跡在視頻中交叉重疊，超出了軟件的分析能力，迫使研究人員不得不將這些“無法追蹤"的個體數據排除（圖1中紅色方框標出的時間段）。這本身暗示了在社交環境中，胚胎對毒素的反應模式可能更多樣、更復雜。
隔離飼養：一個“安靜"且反應遲鈍的世界
與群養組形成鮮明對比的是圖3（隔離組數據）。在物理隔離的條件下，即使暴露于相同濃度的Rotenone，胚胎的卷尾持續時間（圖2A） 和頻率（圖2C） 曲線與溶劑對照組幾乎重疊，未表現出任何統計學上的顯著差異。
這揭示了一個重要結論：隔離飼養的環境本身，就像為胚胎提供了一個“緩沖墊"，削弱或掩蓋了Rotenone本應引發的行為毒性。當胚胎獨處時，它們對神經毒素的敏感度似乎降低了。
即使沒有毒素，行為也已不同
令人驚訝的發現來自對照組的直接比較（圖3）。即使雙方都未接觸任何毒素，僅僅因為飼養方式不同，它們的行為發育軌跡就出現了顯著分歧：行為發育曲線差異，即隔離飼養的胚胎在發育早期（約24小時）缺失了群養組中普遍存在的“初始活動高峰"（圖3B）。這個高峰被認為是神經系統發育中不同神經遞質系統開始整合并驅動協調運動的關鍵標志。
活動水平整體偏低：在整個觀測前期，隔離胚胎的卷尾頻率顯著低于群養胚胎（圖3B）。這意味著，沒有同伴的刺激，胚胎的自發運動發育似乎啟動得更慢、更“慵懶"。
后期“追趕"現象：直到發育后期（約32小時后），隔離胚胎的卷尾持續時間才逐漸追上并超過群養胚胎（圖3A），這可能是一種代償性或延遲的發育模式。
黑暗中的反應：社交環境調節應激響應
圖4進一步分析了胚胎在光照突變（37.5 hpf時由亮轉暗）這一應激刺激下的行為變化。結果發現：在群養組中，溶劑對照和低濃度Rotenone組在變暗后活動顯著增加。而在隔離組中，只有較高濃度Rotenone暴露的個體才對黑暗刺激表現出明顯的頻率增加。這表明，社交環境（群養）能增強胚胎對輕度環境刺激（如黑暗）的反應性，而隔離環境則可能使胚胎僅對更強的刺激（如高濃度毒素疊加黑暗）產生反應。
本文介紹的研究揭示了一個重要卻常被忽視的事實：即使是胚胎階段的斑馬魚，其行為也受到社交環境的顯著影響。在評估神經毒性時，飼養條件可能成為一個“隱藏變量"，干擾數據的解讀與化學物質毒性的真實判斷。這項研究提醒我們：生命從來不是孤立的實驗單元，社交與環境交織成的網絡，深深影響著個體對壓力的反應——即使這個個體，只是一個尚未孵化的斑馬魚胚胎。
von Hellfeld, Rebecca, et al. “Rearing conditions (isolated versus group rearing) affect rotenone-induced changes in the behavior of zebrafish (Danio rerio) embryos in the coiling assay." Environmental Science and Pollution Research 31.43 (2024): 55624-55635.
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